Прежде чем попасть на рынок, любое новое лекарственное средство должно пройти обязательную проверку на содержание различных потенциально опасных примесей. Следы бактериального загрязнения проверяют при помощи животных, которым уже более 400 млн лет и у которых особенная кровь.

Контроль качества

Если следовать сухой букве закона, точнее, XIII изданию Государственной фармакопеи Российской Федерации, введенной в действие 1 января 2016 года, для оценки чистоты и обеспечения безопасности применения абсолютно всех фармацевтических субстанций используются различные биологические тесты по следующим показателям: «Микробиологическая чистота», «Стерильность», «Пирогенность», «Бактериальные эндотоксины».

Испытание субстанций на стерильность проводят в тех случаях, когда не предусмотрена процедура стерилизации при производстве стерильных лекарственных форм. Для нестерильных лекарственных средств, в том числе содержащих живые микроорганизмы, а также для вспомогательных веществ предусмотрена оценка качества по показателю «Микробиологическая чистота».

Субстанции, используемые в производстве лекарственных препаратов для парентерального применения, дополнительно стандартизуются по показателям «Пирогенность» и/или «Бактериальные эндотоксины» (ЛАЛ-тест). Пирогенность, как правило, имеет микробное происхождение, пирогенные реакции способны вызывать живые и погибшие микроорганизмы или продукты их распада, оценка безопасности по этому параметру выполняется на кроликах.

В настоящее время все чаще находит применение тест «Бактериальные эндотоксины», более чувствительный и точный метод. Кроме того, ЛАЛ-тест можно использовать для контроля качества субстанций, не растворимых в воде, а также он является валидируемой процедурой в отличие от эксперимента на кроликах.

ЛАЛ, что?

Что же скрывается за тремя странными буквами в названии теста? ЛАЛ (LAL) – лизат амебоцитов Limulus. Легче не стало, да. Но если начать разбирать это название с конца, многое проясняется. Limulus polyphemus – это уникальные членистоногие, мечехвосты, появившиеся на Земле около 450 млн лет назад. Более 70 их видов уже вымерли, остались четыре, которые обитают на мелко­водьях российского Дальнего Востока, Юго-Восточной Азии и на Атлантическом побережье Северной Америки. Внутри них есть гемолимфа – подобие крови, которая свободно омывает все внутренние органы, у членистоногих нет столь развитой кровеносной системы, как у тех же млекопитающих. В этой крови обитают клетки, аналоги наших лейкоцитов. Они называются амебоциты и выполняют примерно те же защитные функции. И из них готовят лизат.

При контакте с бактериальными эндотоксинами происходит помутнение изначально прозрачной реакционной смеси или образование геля, что и служит сигналом присутствия недопустимой примеси. Впервые этот метод был описан в 1964 году, после чего он очень быстро вытеснил кроликов с пирогенным тестом. Среди его преимущств – высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, дешевизна при массовом применении, быстрота, на получение результата уходит всего 1,5–2 часа. Мало того, при помощи ЛАЛ-теста стал возможен межстадийный контроль качества при приготовлении инъекционных препаратов.

Впервые ЛАЛ-тест был включен в фармакопею США в 1980 году, чуть позже его признала и Европа. В нашей стране ЛАЛ-тест официально описан в 1997 году, с 2007 года он присутствует в Государственной фармакопее. По сути, ни одно лекарство в мире не получит маркетингового разрешения или регистрационного удостоверения без контроля ЛАЛ-тестом. Предел чувствительности в отношении бактериальных эндотоксинов – 0,001 ЕЭ/мл, недостижимая для других методов цифра.

Обратная сторона медали

Если с ЛАЛ-тестом все так хорошо, где-то обязательно должно быть плохо. И плохо в этой истории мечехвостам. Потому что для получения ЛАЛ они сдают свою гемолимфу на специально оборудованных «станциях переливания», причем согласия на эту процедуру у них никто не спрашивает.

Если бы жидкость имела красный цвет, как человеческая кровь, может, это и остановило бы ее собирателей, но гемолимфа меченосцев – серо-голубая и никаких ассоциаций не навевает. Разве что с фантастическими фильмами про чужих.

Откуда взялся такой необычный цвет?

Живые организмы на нашей планете дышат кислородом – либо из атмосферы, либо из воды. Для его захвата и обмена на углекислый газ существуют специальные белки-переносчики. У человека, его родственников-млекопитающих, птиц, рептилий, рыб, амфибий кровь красная. Обеспечивается это железосодержащим гемоглобином. А вот у мечехвостов, как и у некоторых других морских обитателей, эту роль играет гемоцианин, белок, построенный вокруг ионов меди. Именно она в оксигенированном варианте придает гемолимфе столь фантастический оттенок.

Процедура сбора гемолимфы выглядит следующим образом: выловленных из океана мечехвостов выставляют на специальных штативах и собирают около 30% циркулирующей в них жидкости, после чего выпускают обратно в воду. Производители уверяют, что таким образом соблюдают баланс и не наносят вреда ни животным, ни экосистеме.

Ученые снабдили мечехвостов датчиками, отследив их дальнейшую судьбу, и выяснили, что примерно треть из них после возвращения в океан погибают, выжившие самки откладывают меньше икры и в целом куда менее активны, чем не попавшие на «станцию переливания» сородичи. Численность американских мечехвостов приблизилась к порогу, за которым – статус исчезающего вида.

В поисках альтернативы

В качестве замены животным-донорам предлагается синтетический вариант ЛАЛ – рекомбинантный фактор С, который производится биотехнологическим способом. При контакте с эндотоксином, в отличие от классического ЛАЛ, он начинает флюоресцировать. Однако натуральный препарат содержит как минимум три фактора – С и В, реагирующие на эндотоксины, и G, распознающий бета-1,3-глюкан из бактериальных стенок, то есть это система тройной прочности в отличие от синтетического аналога.

В 2012 году FDA и EMA, американский и европейский регуляторы, признали рекомбинантный фактор С приемлемой альтернативой ЛАЛ, в Еврофармакопее он окончательно закрепился в 2016 году, а вот из американской в 2020-м был исключен, так что всем желающим выйти на американский рынок все еще приходится пользоваться гемолимфой мечехвостов. Не исключено, что в будущем подходящая замена все-таки будет найдена и угроза вымирания для древних животных минует.

Гемоцианин на мышиных моделях успешно справлялся с раком мочевого пузыря, действуя как иммунотерапевтическое средство. В клеточных культурах он также оказался эффективен против рака молочной железы и аденомы простаты.

Алексей Водовозов

Журнал "Российские аптеки" №5, 2021

1. Piehler M., Roeder R., Blessing S., Reich J. Comparison of LAL and rFC Assays-Participation in a Proficiency Test Program between 2014 and 2019 // Microorganisms. 2020 Mar 16;8(3):418. doi: 10.3390/microorganisms8030418. 2. Marius M., Vacher F., Bonnevay T. Comparison of Limulus Amoebocyte Lysate and Recombinant Factor C Assays for Endotoxin Detection in Four Human Vaccines with Complex Matrices // PDA J Pharm Sci Technol. 2020 Jul-Aug;74(4):394-407. doi: 10.5731/pdajpst.2019.010389. Epub 2020 Mar 16. 3. Owings M., Chabot C., Watson W. 3rd. Effects of the Biomedical Bleeding Process on the Behavior of the American Horseshoe Crab, Limulus polyphemus, in Its Natural Habitat // Biol Bull. 2019 Jun;236(3):207-223. doi: 10.1086/702917. Epub 2019 Apr 15. 4. Maloney T., Phelan R., Simmons N. Saving the horseshoe crab: A synthetic alternative to horseshoe crab blood for endotoxin detection // PLoS Biol. 2018 Oct 12;16(10):e2006607. doi: 10.1371/journal.pbio.2006607.